Наша реклама

Поиск

Рекомендуемая методика

Posted 6/14/2009 в 6:42:14 ДП

Используют чашки Петри или прямоугольные лотки, заполненные на глубину 3—4 мм, если нет других указаний в частной статье, культуральной средой, предварительно засеянной соответствующей культурой чувствительного тест-организма, приготовленного, как описано ниже. Питательный агар может состоять из двух отдельных слоев, из которых только верхний слой может быть засеян. Концентрация тест-организма должна быть подобрана таким образом, чтобы получить четкие зоны угнетения в соответствии с ответами на дозу с различными концентрациями стандарта. Если посев готовят, как описано ниже, засеянная среда обычно содержит 1 мл посевного материала на 100 мл культуральной среды. Если культура состоит из суспензии вегетативных клеток, температура расплавленной для засева агаровой среды не должна превышать 48—50° С. Следует специально отобрать чашки и лотки с плоским дном; во время заполнения их устанавливают «а ровной горизонтальной поверхности для обеспечения одинаковой толщины слоя среды. При использовании некоторых тест-организмов методику можно усовершенствовать, перед употреблением высушивая засеянные лотки при комнатной температуре в течение 30 мин или помещая их в холодильник при 4°С на несколько часов.
Для нанесения испытуемого раствора на поверхности засеянной среды расставляют небольшие стерильные цилиндры одинакового размера высотой приблизительно 10 мм и внутренним диаметром около 5 мм, из стекла, фарфора или нержавеющей стали. Вместо цилиндров иногда в слое среды стерильным бором делают отверстия диаметром 5— 8 мм. Можно использовать и другие методы нанесения испытуемого раствора. Испытуемый раствор надо располагать так, чтобы избежать перекрывания (совпадения) зон.
Растворы стандартного образца известной концентрации и соответствующие растворы 'испытуемого вещества, имеющие концентрации предположительно того же порядка, готовят в стерильном буферном растворе с подходящим значением рН. Для оценки правильности количественного определения необходимо использовать не менее 3 различных доз стандартного образца вместе с равным количеством доз испытуемого вещества, имеющих предположительно ту же активность, что и растворы стандартного образца. Уровни доз должны соотноситься в геометрической прогрессии, например, готовят серию разведений в отношении 2:1. Если известно, что отношение между логарифмом концентрации антибиотика и диаметром зон угнетения является приблизительно прямолинейным
для используемой системы, рутинные анализы можно проводить, используя только 2 концентрации стандартного образца и 2 концентрации испытуемого вещества. Если в частной статье указано приготовление исходного раствора испытуемого вещества, этот раствор затем разводят, как необходимо, подходящим стерильным буферным раствором.
Если применяют прямоугольные лотки, растворы стандартного образца и испытуемого вещества предпочтительно располагать по методу латинских квадратов. Если используют чашки Петри, растворы располагают так, чтобы на каждой чашке растворы стандартного образца и испытуемого вещества чередовались по кругу и были размещены таким образом, чтобы наивысшие концентрации стандартного образца и испытуемого вещества не были рядом. С помощью пипетки отмеривают и вносят в цилиндры или отверстия одинаковое количество растворов. Если используют отверстия, отмериваемый объем должен быть достаточным, чтобы почти доверху заполнить отверстие.
Чашки и лотки инкубируют при подходящей температуре, контролируемой с точностью ±0,5° С, приблизительно 16 ч; при помощи подходящего устройства точно измеряют диаметры или площади зон угнетения, вызванного различными концентрациями стандарта и испытуемого вещества, желательно до 0,1 мм фактического размера зоны. По результатам рассчитывают активность испытуемого образца. Ниже (см. с. 170) перечислены публикации по статистическим ме-. тодам оценки биологических количественных определений.
Условия проведения количественного определения активности отдельных антибиотиков и подходящие тест-организмы указаны в соответствующих частных статьях. Решающее значение для количественного определения может иметь выбор подходящего штамма тест-организма. Для облегчения справочного поиска примеры подходящих тест-организмов для ряда антибиотиков приведены в табл. 4, в которой использованы следующие обозначения штаммов. NCTC — Национальная коллекция типов культур, Центральная лаборатория общественного здравоохранения, Колиндейл, Лондон, Англия NCYC — Национальная коллекция дрожжевых культур, Фонд научных исследований пивоваренной промышленности, Натфилд, Ред-Хилл, Суррей, Англия АТСС — Американская коллекция типов культур, Роквилл, штат Мэриленд 20852, США. Можно использовать другие подходящие штаммы тест-организмов. Дополнительная информация об источниках подходящих штаммов может быть получена в секции стандартизации биологических препаратов, Всемирная организация здравоохранения, Женева, Швейцария.

Точность количественного определения
Для того чтобы определить, соответствует ли данное вещество требованиям в отношении активности, указанным в частной статье, количественное определение следует, если необходимо, повторить для достижения требуемой точности. Эта точность должна быть такова, чтобы пределы достоверности (Р = 0,95) средней величины найденной активности, выраженной в процентах средней найденной активности, находились в пределах требуемого интервала, приведенного в индивидуальной статье.
>
Вычисление результатов
В перечисленных ниже публикациях описаны подходящие методы, которые можно использовать для статистичской оценки микробиологических количественных определений антибиотиков.
1. Международная фармакопея, издание второе, Женева, Всемирная организация здравоохранения, 1969, приложение 45: Количественное определение и испытание биологической активности.
2. С. I. Bliss: Statistics of bioassay, New York. Academic Press, 1952.
3. C. I. Bliss: Statistics in biology, vol. I., New York, McGraw Hill, 1967.
4. С I. Bliss: Statistics in biology, vol. II, New York, McGraw Hill, 1970.
5. D. J. Finney: Statistical methods in biological assays, London, Griffin, 1964.
6. W. Hewitt: Microbiological assay, New York, Academic Press, 1977.
7. J. Philippe: Les methodes statisstiques en pharmacie et en chimie, Paris, Masson, 1967.
Методы статистической оценки микробиологических количественных определений антибиотиков также описаны во многих национальных и региональных фармакопеях.
Культуральные среды
Состав культуральных сред (Кс), упомянутых в табл. 4, приведен в «Описке реактивов, испытательных и титрованных растворов» (см. с. 189). В каждом случае окончательное значение рН доводится до величины, указанной в таблице.
Приготовление тест-культур
Bacillus cereus; BacUlus pumilus; Bacillus subtilis. Тест-культуру выращивают ь течение 7 сут при температуре 37—39 °С «а поверхности культуральной среды Kcl (рН 6,5— 6.6 после стерилизации), к которой добавлен 1 мкг сульфата марганца Р на 1 мл. Культуру, состоящую в основном из спор, смывают стерильной водой, нагревают в течение 30 мин при 70° С и разводят соответствующим образом, например, до содержания 107—108 спор в 1 мл. Суспензию спор можно хранить в течение длительного времени при температуре не выше 4° С.
Bordetella bronchiseptica. Тест-культуру выращивают в течение ночи на культуральной среде Кс2 (рН 6,5—6,6 после стерилизации) при температуре 35—37 °С. Суспензию готовят смыванием культуры и разведением изотоническим стерильным раствором ИР или водой до определенной степени мутности взвеси, такой, например, при которой слой толщиной 1 см при 650 нм пропускает 50% падающего света. Суспензию можно хранить в течение 2 нед при температуре не выше 4 °С.
Свежеприготовленную тест-культуру можно заменить суспензией этой культуры в .подходящем растворителе, таком, как стерильный пептон (1 г/л)ИР2, которая хранилась замороженной при —70 °С; перед употреблением суспензию соответствующим образом оттаивают.
Micrococcus luteus. Тест-культуру выращивают в течение ночи на культуральной среде Kcl (рН 6,5—6,6 после стерилизации) при температуре 35—37 °С. Суспензию готовят смыванием и разведением изотоническим стерильным раствором ИР до определенной степени мутности взвеси, такой, например, при которой слой разведения (1 часть на 50) толщиной 1 см при 650 нм пропускает 80% падающего света. Суспензию можно хранить в течение 2 нед при температуре не выше 4°С.
Свежеприготовленную тест-культуру можно заменить суспензией этой культуры в подходящем растворителе, таком, как стерильный пептон (1 г/л) ИР2, которая хранилась замороженной при —70 °С; перед употреблением суспензию соответствующим образом оттаивают.
Saccharomyces cerevisiae. Тест-культуру выращивают в течение ночи на культуральной среде КсЗ (рН 6,0—6,2 после стерилизации) при температуре 35—37 °С. Суспензию готовят смыванием и разведением изотоническим стерильным раствором ИР до определенной степени мутности взвеси, такой, например, при которой слой толщиной 1 см при 650 нм пропускает 50 % падающего света. Суспензию можно хранить в течение 2 нед при температуре не выше 4°С.
Свежеприготовленную тест-культуру можно заменить суспензией этой культуры в подходящем растворителе, таком, как стерильный пептон (1 г/л) ИР2, которая хранилась замороженной при —70 °С; перед употреблением суспензию соответствующим образом оттаивают.
Staphylococcus aureus. Тест-<культуру выращивают в течение ночи на культуральной среде Kcl (рН 6,'5—6,6 после стерилизации) при температуре 35—37 °С. Суспензию готовят смыванием и разведением изотоническим стерильным раствором ИР до определенной степени мутности взвеси, такой, например, при которой слой толщиной 1 см при 650 нм пропускает 50% падающего света.
Свежеприготовленную тест-культуру можно заменить суспензией этой культуры в подходящем растворителе, таком, как стерильный пептон (1 г/л) ИР2, которая хранилась замороженной при —70°С; перед употреблением суспензию соответствующим образом оттаивают.