Наша реклама

Поиск

Рекомендуемая методика

Posted 6/14/2009 в 5:26:31 ДП

Электрофорез на бумаге
"? Для определения .пригодна камера длиной около 50 см, шириной. 38 см и глубиной 4,5 см с тдавфтами, .внутренняя длина которых составляет около 37 см, ширина 5 см и "внутренняя глубина 2 см. * .;...; с'' Бумага для электрофореза представляет собой,- игодходя-•щую фильтровальную бумагу (пригодна бумаглоВГатмнн'З.ММ ?ШШг'аналошчная ей), промытая хроматографически ягодходя-•щим^раеттерителем, если в статье есть на это указание. Бумагу разрезают на полоски подходящего размера и.чга_рас-йтфйнии около .13 см от одного конца карандашом прочерчивают базовую линию.
Заполняют кюветы прибора проводящей жидкостью, указанной в статье. Полоски бумаги для электрофореза (около 30X5 см) помещают в кюветы так, чтобы между наружным и внутренним отделениями образовался мостик; электроды должны быть полностью погружены в проводящую жидкость во внутренних отделениях.
Наносят отдельно в точки вдоль базовой линии на бумаге на расстоянии не менее 1 ом от края бумаги и не менее 2,5 см друг от друга объемы растворов, приготовленных, как указано в статье.
Дают пятнам высохнуть и затем помещают конец бумаги,, ближайший к 'базовой линии, во внутреннее отделение кюветы, связанное с анодом, а другой конец бумаги — во внутреннее отделение кюветы, связанное с катодом. С помощью кисти смачивают бумагу проводящей жидкостью, начиная с концов бумаги в направлении базовой линии. Не смачивают полоску, на которой находится нанесенное вещество. Закрывают крышку и дают жидкости диффундировать через базовую линию; если необходимо, закрывают прибор, чтобы защитить его от действия света, соединяют кабель с источником энергии и включают ток. Доводят напряжение примерно до 20 В на 1 см бумаги между 'кюветами и дают процессу протекать в течение указанного времени или до тех пор, пока маркерное вещество не пройдет определенное расстояние. Выключают ток, вынимают бумагу, высушивают в токе воздуха, защищая, если необходимо, от действия света, и оценивают полученную элек-трофореграмму в условиях, описанных в статье. Если статьей предписано применение маркерного вещества, результат испытания считается достоверным только в том случае, если это вещество продвинется от базовой линии на указанное расстояние. Если интенсивность любого дополнительного пятна, полученного с испытуемым веществом, меньше, чем интенсивность пятна, полученного с раствором стандартного образца, вещество соответствует требованиям. Если указано в статье, опрыскивают бумагу равномерно с обеих сторон реактивом, проводят дальнейшую предписанную обработку для завершения реакции и применяют те же критерии для оценки полученных пятен. Электрофорез на полосках ацетата целлюлозы
Предпочтительно использовать камеру меньших размеров, чем при электрофорезе на бумаге; удобна камера размером около 25x24 см с кюветами 10x23 см.
Полоски полиацетата целлюлозы соответствующего качества размером 2,5х 17 см погружают в проводящую жидкость приблизительно за 1 ч до использования.
На полоски на расстоянии 8 см от их конца наносят растворы, приготовленные, как указано в статье, и в указанных объемах, затем проводят электрофорез, как описано в методике электрофореза на бумаге. Полосы окрашивают, промывают и, чтобы они стали прозрачными, обрабатывают методом, указанным в статье, где также описан метод оценки электрофореграмм.
Электрофорез на геле
Внутренний носитель представляет собой слой геля агара или крахмала подходящей консистенции толщиной 1—2 мм и имеет форму удлиненного прямоугольника.
Проводящую жидкость либо вводят в слой геля, либо после того, как гель сформировался, опрыскивают ею слой до полного смачивания. Раствор вещества помещают на поверхность слоя геля или внутрь отверстий, вырезанных в слое для этой цели. Слой геля соединен своими узкими концами с двумя кюветами, содержащими проводящую жидкость; соединение осуществляется при помощи фитилей из двойного слоя марли, смоченной проводящей жидкостью. Затем слой геля на его держателе и соединения помещают в камеру.
Электрофоретический процесс осуществляют с помощью постоянного электрического тока. Для устранения тепла, генерируемого за счет эффекта Джоуля, через пластинку держателя во время испытания должна циркулировать вода или другая подходящая охлаждающая жидкость.
После завершения процесса полученные пятна или площади миграции обнаруживают подходящим методом, указанным в частной статье; например, может быть определена зона угнетения после соответствующей инкубации, если испытуемое вещество является антибиотиком и соответствующий тест-организм был включен в слой геля, или применен какой-либо химический метод.