Наша реклама

Поиск

Жидкостная хроматография высокого давления

Posted 6/14/2009 в 5:05:23 ДП

Этот совсем недавно введенный метод хроматографии вновь выдвинул на передний край исследований хроматографию на колонках — самую старую форму аналитического искусства. Основное достижение, благодаря которому стало возможным применение нового метода, — это техника получения частиц.
устойчивых к высокому давлению и имеющих одинаковый диаметр менее 50 мкм. Эти частицы обычно имеют твердый центр, например из стекла, и тонкий пористый наружный слой, например из кремния; благодаря небольшому размеру и большой площади поверхности эти частицы, будучи применены в адсорбционной хроматографии, обеспечивают очень высокую эффективность метода. Если частицы покрыты подходящей неподвижной фазой, жидкостную хроматографию высокого давления можно использовать как метод распределения.
Для обеспечения стабильности подготовленной колонки неподвижные фазы часто связывают химически с носителем (обычно с помощью сложного или простого эфира). Простая эфирная связь обеспечивает более устойчивый продукт, чем сложноэфирная связь, которая может гидролизоваться полярными растворителями; например, в покрытых октадецилсила-ном бусинках углеводородная цепь связана простой эфирной связью со стеклянными бусинками, покрытыми тонким слоем кремния, и это обеспечивает весьма эффективную систему с обращенной фазой, которая исключительно стабильна в пользовании. Для хроматографирования эти частицы укладывают в колонки с узким отверстием (внутренним диаметром обычно 2—4 мм); вполне очевидно, что такой мелкий материал, упакованный в колонки длиной до 1 м, будет создавать значительное сопротивление потоку подвижной фазы, в силу чего и должно применяться высокое давление. Типичная длина колонок составляет 20—30 см, а условия, обычные для количественного анализа, — скорость потока около 1—3 мл в минуту и давление до 28 000 кПа (4000 фунтов/дюйм2).
Совсем недавно появились кремниевые шарики с одинаковым диаметром около 5 мкм; они полностью пористые и могут иметь площадь поверхности до 300 м2/г. Соответственно они дают более эффективные разделения, чем частицы размером 30—50 мкм. Для приготовления колонок большие частицы можно укладывать сухими, но для частиц диаметром 5 мкм в основном используется суспензионный способ заполнения колонки.
Кроме адсорбционного и распределительного способов, рассмотренных выше, принцип метода высокого давления применим и к ионообменной хроматографии при условии, что имеются подходящие смолы в виде достаточно мелких, устойчивых к давлению частиц.
Естественно, что такое высокое давление требует и специального оборудования. К основным частям прибора относятся подходящий насос для подачи подвижной фазы из закрытого резервуара растворителя на колонку, приспособления для введения испытуемого раствора в колонку (обычно это вид инжекторного клапана, предназначенного для работы три высоком давлении), сама колонка (часто определение происходит при комнатной температуре, но иногда колонка выдерживается при температуре до 100° С), соответствующая детекторная система и усилитель, связанный с подходящим регистрирующим устройством, таким, как ленточный самописец, позволяющий выстроить график зависимости сигналов от времени, или электронный интегратор.
В качестве детекторов на настоящей стадии разработки метода наиболее часто применяются устройства, основанные на ультрафиолетовой спектрофотометрии, на измерении показателя преломления или на измерениях флуоресценции. Для фармацевтических целей наиболее подходящим является ультрафиолетовый спектрофотометр, обладающий высокой чувствительностью (низший уровень обнаружения составляет 1—2 нг для материала, имеющего хорошие светопоглощающие свойства) и стабильностью (в частности он отличается низкой чувствительностью к контролируемым изменениям в составе растворителя и неравномерности потока); естественно, что такой детектор не может быть использован, если элюируется материал, не имеющий заметного поглощения в ультрафиолетовой области. Рефрактометр реагирует на разницу в показателе преломления чистой подвижной фазы и подвижной фазы, содержащей элюируемый материал; этот метод имеет более широкое применение, чем адсорбционная спектрофотометрии в ультрафиолетовой области, но он малочувствителен и в значительной степени зависит от небольших изменений в составе растворителя, от скорости потока и температуры.
В некоторых случаях, в частности, в опытах, имеющих целью определение оптимального состава растворителя для метода, который затем 'будет использоваться повседневно, удобна методика градиентного элюирования. Состав смеси растворителей, входящих в подвижную фазу, во время хрома-тографирования непрерывно меняют с предварительно установленной скоростью, что дает возможность решать при помощи одной хроматограммы проблему разделения сложной смеси веществ, имеющих совершенно различные коэффициенты распределения. Коэффициент распределения К, как указано в разделе «Газовая хроматография» (см. ниже), является мерой количества растворенного вещества в неподвижной фазе по отношению к концентрации вещества в подвижной фазе. При использовании методов расчета, аналогичных описанным в разделе «Газовая хроматография», методика высокого давления дает возможность получать результаты высокой точности и поэтому она чрезвычайно удобна для количествен-
ных определений. Эта методика отнимает мало времени и используется для осуществления многих высокоэффективных .разделений, однако для ее применения нужны специальные приборы и во многих случаях дорогостоящие материалы для колонок. Потенциальное преимущество этой методики перед газовой хроматографией состоит в том, что летучесть и термостабильность, факторы столь важные для последней, не имеют никакого значения при жидкостной хроматографии. К ее недостаткам в настоящее время относится отсутствие универсально применимых детекторных систем.