Наша реклама

Поиск

Тонкослойная хроматография

Posted 6/14/2009 в 4:57:07 ДП

В тонкослойной хроматографии адсорбентом служит тонкий, равномерный слой (обычно толщиной около 0,24 мм) сухого мелкоизмельченного материала, нанесенного на подходящую подложку, например на стеклянную пластинку, алюминиевую фольгу или пластмассовую пленку. Подвижная фаза движется по поверхности пластинки (обычно под действием капиллярных сил); хроматографический процесс может зависеть от адсорбции, распределения или комбинации обоих явлений, что в свою очередь зависит от адсорбента, его обработки и природы используемых растворителей. Во время хроматографирования пластинка находится в хромато-графической камере (чаще всего изготовленной из стекла, чтобы можно было наблюдать движение подвижной фазы по пластинке), которая обычно насыщена парами растворителя. В качестве твердого носителя часто используются силикагель, кизельгур, окись алюминия и целлюлоза; для лучшего сцепления с носителем к нему можно прибавлять соответствующие вещества, например сульфат кальция (гипс). Для изменения свойств приготовленного слоя его можно пропитать буферными материалами, чтобы получить кислый, нейтральный или основной слой; можно использовать и другие вещества, такие, как нитрат серебра. В некоторых случаях слой может состоять из ионообменной смолы. Такой широкий диапазон различных слоев, используемых в сочетании с разными
системами растворителей, дает почти неограниченную возможность изменять силу разделения, что делает тонкослойную хроматографию столь полезным методом для фармацевтического анализа.
В испытаниях на подлинность тонкослойная хроматография служит для сравнения поведения идентифицируемого материала и стандартного образца, обычно аутентичного исследуемому веществу. Если оба вещества продвигаются во время хроматографического процесса на одинаковое расстояние и если оба вещества, смешанные и подвергнутые хромато-графированию, движутся как единое вещество, можно предположить, что эти вещества идентичны. Это предположение может быть подтверждено повторением той же процедуры с использованием другой хроматографической системы; как правило, если два вещества ведут себя идентично в трех совершенно различных системах, предположение об их идентичности вполне обосновано.
Для установления подлинности удобно определять отношение расстояния, пройденного неизвестным веществом, к расстоянию, пройденному либо фронтом растворителя, либо стандартным образцом. На полученной хроматограмме отношение расстояния, пройденного на адсорбенте данным веществом, к расстоянию, пройденному передним краем растворителя или подвижной фазы (оба расстояния измеряют от точки нанесения испытуемого вещества), есть величина Rf, характерная для данного вещества в данной хроматографической системе. Отношение расстояний, пройденных испытуемым веществом и стандартным образцом, принимают за величину Rr. На практике величины Rf могут значительно варьировать в зависимости от конкретных экспериментальных условий, поэтому величина Rr, определенная по отношению к стандартному образцу, подвергнутому хроматографированию на той же пластинке, имеет более достоверное числовое значение. Еще более надежные результаты дает сравнение с аутентичным образцом, как описано выше, и именно эта методика используется для фармакопейных целей.
Для определения положения неокрашенного вещества на полученной хроматограмме обычно необходимо обрабатывать хроматограмму реактивом, который либо обугливает разделенные вещества, либо переводит их в окрашенные или флуоресцирующие производные. Часто применяют и другой удобный метод: проводят хроматографию на пластинке, пропитанной веществом, сильно флуоресцирующим под воздействием коротковолнового ультрафиолетового света. Площади на пластинке, занятые веществами, поглощающими при той же длине волны, выглядят как темные пятна на флуоресцирующем фоне. В особых случаях можно использовать и другие средства обнаружения, например, определять радиоактивность, если разделяются меченые соединения, или получить микробиологический ответ, когда речь идет об антибиотиках.
Наиболее ценные результаты дает применение тонкослойной хроматографии в качестве метода оценки низких уровней примесей в медицинских веществах. Для этой цели вещество наносят на хроматографическую пластинку и после хроматографирования любые вторичные пятна, которые могут быть видны на хроматограмме после соответствующего проявления, сравнивают по размеру и интенсивности с пятнами, которые дают небольшие количества ожидаемых примесей при одновременном хроматографировании на той же пластинке. Для этой методики нужно иметь в наличии ожидаемые примеси, поэтому в некоторых статьях предписывается использование аутентичных образцов примесей. Часто бывает, что в лабораториях этих примесей нет; в таких случаях можно сравнивать вторичные пятна, образующиеся от следовых количеств примесей, с пятном, полученным при хроматографировании на той же пластинке соответствующего небольшого количества испытуемого вещества. Этот прием не всегда возможно применить, так как примеси и испытуемое вещество могут по-разному реагировать на метод обнаружения, однако с его помощью можно получить приемлемый критерий, то которому можно судить об уровне примеси в веществе. Третья, иногда рекомендуемая методика состоит в нанесении такого количества испытуемого вещества, при котором после хроматографировании не появляется никаких вторичных пятен, если образец приемлемо чист. Это наименее удовлетворительный из всех трех методов, так как возможность увидеть вторичное пятно зависит от субъективных особенностей наблюдающего, а интенсивность пятен на хроматограмме может значительно варьировать в зависимости от конкретных условий хроматографировании.
Для количественных измерений пятно можно удалить с пластинки, вещество элюировать подходящим растворителем, а затем определить его достаточно чувствительным методом, таким, как спектрофотометрическое измерение, либо непосредственно, либо после какой-либо химической реакции. В некоторых случаях количественную оценку также можно провести путем измерения интенсивности пятна с помощью сканирующего денситометра и последующего сравнения этой интенсивности с интенсивностями пятен, полученных со стандартными количествами того же аналогично обработанного вещества.
Методы разделения с применением тонкослойной хроматографии иногда могут быть усовершенствованы путем многократного хроматографирования (хроматограмме дают высохнуть и вновь хроматографируют в той же системе), непрерывного хроматографирования (подвижная фаза непрерывно испаряется с верхнего края поверхности адсорбента) или двухмерного хроматографирования (хроматограмме дают высохнуть, повопачивают под прямым углом и затем вновь хроматографвд>уют, часто в иной системе растворителей, чем та, что была использована первоначально). Однако интерпретировать результаты хроматографии, если используются такие процессы промежуточного высушивания, надо с осторожностью, так как во время хроматографирования на пластинке может происходить разрушение вещества, например вследствие окисления. Методика двухмерной хроматографии имеет особую ценность для заключения о химических изменениях, происходящих в процессе хроматографирования. Если смесь вначале хроматографируют в одном направлении, а затем под прямым углом в той же системе растворителя, пятна, соответствующие разделенным веществам, будут лежать на пластинке по диагонали при условии, что не возникнет никаких артефактов.
При тонкослойной хроматографии сорбент обычно распределяют тонким .равномерным слоем на подложке. Это можно выполнить в аналитической лаборатории, но удобно пользоваться и имеющимися в продаже готовыми хроматографиче-скими сорбентами, закрепленными на стеклянной пластинке, пластмассовой пленке или на металлической фольге. К сожалению, хроматографический процесс может быть настолько чувствителен к небольшим изменениям в условиях опыта, что эти имеющиеся в продаже различные материалы и аналогичные приготовленные в лаборатории пластинки не всегда взаимозаменяемы. Характеристики разделения, полученные с коммерческими пластинками силикагеля, и характеристики, полученные с пластинками, приготовленными в лаборатории с тем же сорбентом, который 'был использован фирмой-изготовителем, могут быть совершенно различными. Бывают случаи, когда вполне удовлетворительный метод разделения, разработанный с использованием приготовленных в лаборатории пластинок, не дает положительных результатов при использовании готовых пластинок, и наоборот. Поэтому, переходя с одного типа пластинок на другой, следует соблюдать особую осторожность и всегда предварительно проверять степень пригодности новой пластинки.
Хроматографическая камера, в которой проводят процесс хроматографирования, должна быть защищена от действия света, если предполагается, что исследуемые материалы могут быть светочувствительны. В любом случае хроматографи-ческая камера должна быть защищена от прямых солнечных лучей, так как лучи могут подвергаться различной степени преломления из-за дефектов стеклянных стенок камеры. В результате на пластинке образуются области .повышенной температуры и нарушается правильное перемещение подвижной фазы.